Detección de la subunidad NMDAR-1 del receptor N-metil-D-asparato (NMDAR) en el hipotálamo del ovino mediante el análisis de Western blot / Detection of the N-methyl-D-asparate receptor subunit-1 (NMDAR-1) in the hypothalamus of the sheep bye Western blot analysis

Los aminoácidos excitatorios (AAEs), L-glutamato y aspartato, son considerados las principales sustancias endógenas neuroactivas involucradas en la transmisión excitatoria. El receptorN-metíl-D-aspartato (NMDAR) es uno de los principales receptores de los AAEs. Este receptor estimula la secreción de la hormona luteinizante (LH) al facilitar la secreción de la hormona liberadora de las gonadotrofinas (GnRH). En este estudio se plantearon dos objetivos: Estandarizar la técnica de Western blot para identificar la subunidad-1 del NMDAR (NMDAR-1) en hipotálamo del ovino; y determinar si existe diferencia en la distribución de la NMDAR-1 en los diferentes cuadrantes hipotalámicos (cuadrantes dorsal-rostral, ventral-rostral, dorsal-caudal, y ventral-caudal) del ovino. Se utilizaron 100 µg de proteína total para identificar la NMDAR-1 en el hipotálamo ovino. Se evidenció un efecto del cuadrante o porción del hipotálamo ovino sobre la expresión proteica de la NMDAR-1. En particular, el cuadrante dorsal-rostral (31,5567 densidad óptica ± 13,0831;P<0,05) expresó más cantidad del receptor que el cuadrante ventral caudal (17,1517 densidad óptica ± 13,0831; P<0,05) y que el cuadrante ventral-rostral (16,4683 densidad óptica ±13,0831; P<0,05). Estos resultados demuestran que el receptor NMDA se expresa más en la región rostral del hipotálamo del ovino, área en la cual se encuentran distribuidos los cuerpos celulares y axones de las neuronas productoras de GnRH. Estos resultados sugieren la participación de la vía glutamatérgica en la regulación de la reproducción de los ovinos.

The excitatory amino acids (EAAs), L-glutamate and aspartate, are considered the major endogenous neuroactive substances involved in excitatory neurotransmission. The N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) is one of the main excitatory amino acid receptors. Exogenous activation of the NMDAR results in the release of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) from the hypothalamus and subsequent release of luteinizing hormone (LH) from the anterior pituitary. The present study had two aims: to standardize the optimal amount of total protein required to identify the NMDAR subtype-1 (NMDAR-1) in the hypothalamus of the sheep; to determine whether a difference exists in the distribution of NMDAR-1 in different hypothalamic regions (dorsal-rostral, ventral-rostral, dorsal-caudal, and ventral-caudal quadrant) in male sheep. The optimal amount of total hypothalamic protein required to visualize the NMDAR-1 was 100 µg. There was an effect of quadrant on the expression of NMDAR-1 in the hypothalamus of the intact male sheep. In particular, dorsal-rostral quadrant (31.5567 optical density ± 13.0831) expressed more receptor than ventral-caudal quadrant (17.1517 optical density ± 13.0831; P<0.05) and ventral-rostral quadrant (16.4683 optical density ± 13.0831; P<0.05). These data suggest that NMDAR is more expressed in the rostral area of the hypothalamus, where the cell bodies and axons of the GnRH neurons are localized. Thus, these data allow suggest that glutamatergic pathway potentially is involved in modulating the reproductive activity in the ovine.

Amplificación del adn de la subunidad-1 del receptor n-metil-d-aspartato (nmdar-1) en el hipotálamo ovino mediante la técnica de rt-pcr / Dna amplification of the n-methyl-d-aspartate receptor subunit-1 (nmdar-1) in sheep hypothalamus by rt-pcr

El receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR), uno de los principales receptores de los aminoácidos excitatorios, ha sido involucrado en el control de la secreción de la hormona luteinizante (LH) al facilitar la liberación de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH). La capacidad del NMDAR para estimular la liberación de la LHRH está significativamente comprometida en animales castrados. En este estudio se plantearon tres objetivos: Primero, estandarizar las condiciones óptimas para re-amplificar el ADN de la subunidad-1 del NMDAR (NMDAR-1) en ovino. Segundo, determinar si existe diferencia en la distribución del ADN de la NMDAR-1 en los diferentes cuadrantes hipotalámicos del ovino no castrado y finalmente, determinar si las hormonas sexuales testiculares están involucradas en la expresión del NMDAR en el hipotálamo. El ADN de la NMDAR-1 procedente de cuatro cuadrantes del hipotálamo (cuadrantes dorsal-rostral, ventral-rostral, dorsal-caudal, y ventral-caudal) fue amplificado mediante la técnica de RT-PCR. Las condiciones óptimas encontradas para amplificar el ADN de la NMDAR-1 fueron 1,5 mM CIMg2, 100 nM de los oligonucleótidos iniciadores y 59°C como temperatura de hibridación. No se observó efecto del cuadrante del hipotálamo sobre la expresión del ADN de la NMDAR-1 en el hipotálamo del ovino no castrado. La castración redujo (P < 0,05) la expresión del ADN para el NMDAR-1, comparado con la de animales no castrados. Estos resultados sugieren que el NMDAR-1 se encuentra distribuido ampliamente en el hipotálamo del ovino. Además, a través de estos resultados se puede presumir que la expresión del receptor NMDA en el hipotálamo del ovino está afectada por las hormonas sexuales esteroideas.

The N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR), one of the excitatory amino acid receptors, has been implicated in the control of luteinizing hormone (LH) secretion through facilitation of luteinizing hormone releasing-hormone (LHRH). Interestingly, the ability of NMDAR to stimulate LHRH release is significantly compromised in castrated animals. The present study had three aims. Firstly, to standardize the optimal conditions used to amplify the DNA for NMDAR subtype-1 (NMDAR-1) in the sheep. Second, to determine whether a difference exists in the distribution of DNA for NMDAR-1 in different hypothalamic regions in intact male sheep. Finally, to determine if testicular steroid hormones are involved in NMDA receptor expression in the hypothalamus. The DNA of NMDAR-1 was amplified by RT-PCR in four quadrants of the hypothalamus (dorsal-rostral, ventral-rostral, dorsal-caudal, and ventral-caudal quadrant) of intact and castrated male sheep. The optimal conditions to amplify the DNA of NMDAR-1 were 1.5 mM MgCl2, 100 nM of primers and 59°C annealing temperature. In experiment 1, there was no effect of quadrant on the DNA expression of NMDAR-1 in the hypothalamus of the intact male sheep. Experiment 2 revealed that castration reduced (P < 0.05) the expression of DNA for NMDAR compared to that in intact males. Taken together, these data suggest that NMDAR-1 is widely expressed in the hypothalamus of male sheep. Furthermore these experiments suggest that testicular steroid hormones are involved in the regulation of NMDAR-1 expression at the DNA level, which allows understanding of its involvement in the modulation of different activities including reproduction.